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| 產(chǎn)地 | 國(guó)內(nèi) |
| 品牌 | 上海滬崢 |
| 貨號(hào) | HZS0259 |
| 用途 | 僅限科研 |
| 包裝規(guī)格 | 50T/盒 |
| 純度 | 詳詢客服% |
| CAS編號(hào) | |
| 是否進(jìn)口 |
產(chǎn)品名稱：
丙型流感病毒檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）
2．復(fù)性（退火）和延伸溫度
將PCR反應(yīng)所需的成分配置完后，在PCR儀上于94-96℃預(yù)加熱幾十秒至幾分鐘，使模板DNA充分變性，然后進(jìn)入擴(kuò)增循環(huán)。在每一個(gè)循環(huán)中，先于94℃保持30秒鐘使模板變性，然后將溫度降到復(fù)性溫度（一般50-60℃之間），一般保持30秒鐘，使引物與模板充分退火；在72℃保持1分鐘（擴(kuò)增1kb片段），使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個(gè)循環(huán)。重復(fù)這樣的循環(huán)25～35次，使擴(kuò)增的DNA片段大量累積。*后，在72℃保持3-7min，使產(chǎn)物延伸完整，4℃保存。
1．常規(guī)程序
復(fù)性的溫度是PCR擴(kuò)增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為72℃。如果復(fù)性的溫度很高，可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成同一溫度，變成二步法PCR。
3．反應(yīng)時(shí)間
變性步驟一般使用30秒鐘，如果模板的G+C含量較高，或直接用細(xì)胞做模板，變性時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)。復(fù)性時(shí)間有30秒種一般是足夠的。延伸時(shí)間由擴(kuò)增產(chǎn)物的大小決定，一般采用1kb用1分鐘來(lái)保證充足的時(shí)間。
4．循環(huán)次數(shù)
循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān)，在模板拷貝數(shù)為104～105數(shù)量級(jí)時(shí)，循環(huán)數(shù)通常為25～35次。
平臺(tái)效應(yīng)（plateaueffect）：PCR擴(kuò)增過(guò)程后期會(huì)出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長(zhǎng)的現(xiàn)象。原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低，產(chǎn)生的焦磷酸會(huì)出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競(jìng)爭(zhēng)作用，擴(kuò)增產(chǎn)物自身復(fù)性，高濃度擴(kuò)增產(chǎn)物變性不徹底。
5．PCR反應(yīng)液的配制
PCR反應(yīng)體系的配置方式有時(shí)也會(huì)影響反應(yīng)的正常進(jìn)行。常規(guī)方法與其它酶學(xué)反應(yīng)一樣，在*后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒(méi)有帶加熱的蓋子，要求在反應(yīng)液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。
對(duì)于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時(shí)，有時(shí)會(huì)擴(kuò)增不出產(chǎn)物。在遇到這個(gè)問(wèn)題時(shí)，如果將反應(yīng)成分分開(kāi)配制，A管含模板、引物和dNTP，以及調(diào)整體積的H2O，B管含緩沖液、DNA聚合酶和水，然后再將兩管溶液混合起來(lái)，可較好地克服這個(gè)問(wèn)題。
按照常規(guī)的方法配制反應(yīng)體系，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增的問(wèn)題。熱啟動(dòng)（hotstart）PCR操作方式可較好解決這一問(wèn)題。將dNTP、緩沖液，Mg2+和primer先配制好，然后加入一粒蠟珠（如AmpliWaxPCRQam100），加熱熔化，再冷卻，使蠟將溶液封住，*后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有當(dāng)PCR反應(yīng)進(jìn)入高溫階段后，蠟層熔化，所有反應(yīng)成分才會(huì)混合在一起。
丙型流感病毒檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1 樣本前處理
組織：取50mg左右組織用玻璃勻漿器勻漿，勻漿后置入潔凈的1.5ml離心管中；
液體標(biāo)本：取適量標(biāo)本13000rpm離心2min，棄上清。
1.2 DNA提取
1) 對(duì)上述處理好的標(biāo)本加入40ul 核酸提取液，100℃恒溫處理10分鐘，13,000 rpm離心5分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml EP管，-20℃保存；
2) DNA的提取也可以采用北京億森寶公司生產(chǎn)的DNA提取試劑盒（離心柱提取法），請(qǐng)嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
根據(jù)代檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N（N=樣本數(shù)+1
管陰性對(duì)照+1管陽(yáng)性對(duì)照），體系配制如下表：
試劑
WSSV 反應(yīng)液
酶液
用量（樣本數(shù)為N）
20μl
1μl
3. 加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟1提取的DNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取4μl，加入相應(yīng)的
反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1 將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi)；
5. 結(jié)果分析判定
結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置基線（baseline）：一般情況下，對(duì)ABI 7500、7700等儀器設(shè)為6-15cycle，對(duì)PE5700設(shè)為3-15cycle,對(duì)MJ Research Option2設(shè)為6-12cycle。特殊情況可對(duì)基線適當(dāng)調(diào)整。
設(shè)置閾值（threshold）:以閾值線剛超過(guò)陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線（無(wú)規(guī)則的噪音線）的zui高點(diǎn)。
結(jié)果判斷
陽(yáng)性：檢測(cè)樣本Ct值小于等于35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期；
可疑：檢測(cè)樣本Ct值大于35.0且小于40.0，重復(fù)一次實(shí)驗(yàn)，如果Ct值仍小于40.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)期，為陽(yáng)性，否則為陰性；
陰性：檢測(cè)不到樣本Ct值或Ct值為40。
6. 對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的解析
實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染，試劑污染，標(biāo)本交叉污染會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果。
7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線無(wú)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或無(wú)Ct值顯示；
陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且Ct值≤32;
以上條件應(yīng)同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
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